Tomasz Grzybowski

Celem niniejszego opracowania jest sformułowanie zaleceń dotyczących ujawniania śladów biologicznych w laboratorium i postępowania z materiałem dowodowym przekazanym do badań identyfikacyjnych, rekomendowanych przez Polskojęzyczną Grupę Międzynarodowego Towarzystwa Genetyki Sądowej (The Polish Speaking Working Group of the International Society for Forensic Genetics). Opracowanie porządkuje wiedzę z zakresu najistotniejszych etapów badań wstępnych śladów biologicznych, w oparciu zarówno o źródła z piśmiennictwa, jak również wynikające z wieloletniej praktyki badawczej. Wypracowane w toku wieloetapowych konsultacji eksperckich rekomendacje zawarte w niniejszym opracowaniu powinny być wykorzystywane w tworzeniu procedur laboratoryjnych używanych w trakcie realizacji zleceń podmiotów prowadzących postępowania związane z analizą śladów biologicznych.

Markery genetyczne do przewidywania pochodzenia biogeograficznego od wielu lat okazują się skutecznymi narzędziami dla organów ścigania. W tym badaniu podjęliśmy próbę oceny potencjału markerów insercyjno-delecyjnych (InDel) i mikrosatelitarnych (STR) jako pomocniczych polimorfizmów do wnioskowania o pochodzeniu populacji słowiańskiej. W tym celu genotypowaliśmy próbki populacji słowiańskojęzycznych z Białorusi, Czech, Polski, Serbii, Ukrainy i Rosji w w zakresie 46 markerów InDel oraz 15 loci STR za pomocą PCR i elektroforezy kapilarnej oraz analizowaliśmy pod kątem różnicowania między populacjami za pomocą metod bazujących na dystansach genetycznych (FST, analiza głównych składowych i skalowanie wielowymiarowe). Dodatkowo zbadaliśmy próbkę mężczyzny z populacji polskiej o dobrze udokumentowanej genealogii, którego pochodzenie biogeograficzne zostało wcześniej ustalone przez komercyjne usługi genomiczne przy użyciu autosomalnych polimorfizmów pojedynczych nukleotydów (SNP), mitochondrialnego DNA i markerów Y-SNP. Do celów porównawczych wykorzystaliśmy dane genotypowe zebrane w przeglądarce „forInDel” i częstości alleli z wcześniej opublikowanych artykułów. Uzyskane wyniki dla InDels i STR wskazują, że populacje słowiańskie stanowią grupę genetycznie jednorodną, z wyjątkiem Czechów wyraźnie różniących się od pozostałych badanych populacji. Analiza znanej polskiej próbki w aplikacji Snipper dowodzi przydatności markerów InDel jedynie na poziomie kontynentalnym. Z kolei, mikrosatelity nie tylko poprawiają wyniki predykcji, ale są informatywne jako niezależny zestaw markerów pochodzenia biogeograficznego.

Morfologia ludzkiej twarzy jest połączeniem wielu złożonych cech i determinowana jest przez dużą liczbę genów i wzmacniaczy. W niniejszym badaniu analizowano zmienność liczby kopii (CNV) wzmacniacza hs1431 w populacjach pochodzenia środkowoeuropejskiego i południowo-syberyjskiego. Próbki z Europy Środkowej pochodziły od 97 Polaków, natomiast próbki z południowej Syberii pochodziły od 78 Buriatów i 27 Tuwańczyków. CNV analizowano metodą real-time PCR z wykorzystaniem aparatu ViiA™ 7 (Applied Biosystems). Statystycznie istotne różnice w liczbie kopii wzmacniacza hs1431 występowały między populacjami polską a buriacką (p=0,0378), ale nie między populacjami Europy Środkowej i południowej Syberii (p=0,1225). Uzyskane wyniki sugerują, że wzrost liczby kopii wzmacniacza hs1431 jest związany z pochodzeniem biogeograficznym. Jednak wynik ten wymaga rozszerzenia i powtórzenia na większych kohortach. Jest to pierwsze badanie, w którym wykazano zmienności liczby kopii wzmacniacza hs1431 u ludzi.

Wstęp: Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie genomów mitochondrialnych wymaga zazwyczaj wcześniejszej amplifikacji tego materiału genetycznego. Etap PCR może wpływać na jakość uzyskanych danych, szczególnie, gdy stosuje się detekcję heteroplazmii na niskim poziomie.

Cel: Celem niniejszego opracowania było porównanie wiarygodności detekcji homoplazmatycznych i heteroplazmatycznych substytucji w ludzkich genomach mitochondrialnych zamplifikowanych z wykorzystaniem dwóch różnych polimeraz.

Materiał i metody: Pełne genomy mitochondrialne zamplifikowano przy użyciu Long PCR Enzyme Mix z Fermentas lub TaKaRa LA Taq DNA Polymerase z TaKaRa. Biblioteki przygotowano z wykorzystaniem Nextera XT DNA libraries i zsekwencjonowano przy użyciu platformy MiSeq FGx (Illumina). Substytucje w mtDNA identyfikowano dla wariantów mniejszościowych na poziomie powyżej 1%.

Wyniki: Wszystkie substytucje homoplazmatyczne wykryte w produktach PCR zamplifikowanych przy użyciu badanych polimeraz i zsekwencjonowanych na MiSeq FGx były identyfikowane jako homoplazmie za pomocą alternatywnych metod sekwencjonowania. Zaobserwowano, że TaKaRa LA Taq DNA Polymerase jest mniej precyzyjna w detekcji heteroplazmii na niskim poziomie niż enzym Long PCR Enzyme Mix, ponieważ wprowadza więcej fałszywie negatywnych i fałszywie pozytywnych wyników dla wariantów mniejszościowych powyżej poziomu 1%. Niemniej jednak, obie badane polimerazy są tak samo skuteczne w wykrywaniu autentycznych substytucji w mtDNA, dla których warianty mniejszościowe przekraczają poziom 3,61%, zakładając co najmniej 10 000 – krotne pokrycie i sekwencjonowanie bibliotek Nextera XT DNA libraries przy użyciu MiSeq FGx.

Wnioski: Wiarygodność i czułość detekcji heteroplazmii punktowych przy użyciu MiSeq FGx zależy od polimerazy używanej do amplifikacji mtDNA. W związku z tym, zalecane jest zweryfikowanie protokołów laboratoryjnych używanych do detekcji substytucji w mtDNA przed ich zastosowaniem w celach medycznych lub sądowych.