%0 Journal Article
%T Wykrywanie heteroplazmii punktowej na niskim poziomie w ludzkich genomach mitochondrialnych amplifikowanych różnymi polimerazami i sekwencjonowanych przy użyciu platformy MiSeq FGx
%A Skonieczna, Katarzyna
%A Ciesielka, Marzanna
%A Teresiński, Grzegorz
%A Grzybowski, Tomasz
%J Archiwum Medycyny Sądowej i Kryminologii
%V 2023
%R 10.4467/16891716AMSIK.23.011.18686
%N Vol. 73 (2)
%P 131-138
%K mtDNA, genom mitochondrialny, heteroplazmia, heteroplazmia punktowa (PHP), masowe sekwencjonowanie równoległe (MPS)
%@ 0324-8267
%D 2023
%U https://ejournals.eu/czasopismo/amsik/artykul/low-level-point-heteroplasmy-detection-in-human-mitogenomes-amplified-with-different-polymerases-and-sequenced-on-miseq-fgx-platform
%X Wstęp: Wysokoprzepustowe sekwencjonowanie genomów mitochondrialnych wymaga zazwyczaj wcześniejszej amplifikacji tego materiału genetycznego. Etap PCR może wpływać na jakość uzyskanych danych, szczególnie, gdy stosuje się detekcję heteroplazmii na niskim poziomie.
Cel: Celem niniejszego opracowania było porównanie wiarygodności detekcji homoplazmatycznych i heteroplazmatycznych substytucji w ludzkich genomach mitochondrialnych zamplifikowanych z wykorzystaniem dwóch różnych polimeraz.
Materiał i metody: Pełne genomy mitochondrialne zamplifikowano przy użyciu Long PCR Enzyme Mix z Fermentas lub TaKaRa LA Taq DNA Polymerase z TaKaRa. Biblioteki przygotowano z wykorzystaniem Nextera XT DNA libraries i zsekwencjonowano przy użyciu platformy MiSeq FGx (Illumina). Substytucje w mtDNA identyfikowano dla wariantów mniejszościowych na poziomie powyżej 1%.
Wyniki: Wszystkie substytucje homoplazmatyczne wykryte w produktach PCR zamplifikowanych przy użyciu badanych polimeraz i zsekwencjonowanych na MiSeq FGx były identyfikowane jako homoplazmie za pomocą alternatywnych metod sekwencjonowania. Zaobserwowano, że TaKaRa LA Taq DNA Polymerase jest mniej precyzyjna w detekcji heteroplazmii na niskim poziomie niż enzym Long PCR Enzyme Mix, ponieważ wprowadza więcej fałszywie negatywnych i fałszywie pozytywnych wyników dla wariantów mniejszościowych powyżej poziomu 1%. Niemniej jednak, obie badane polimerazy są tak samo skuteczne w wykrywaniu autentycznych substytucji w mtDNA, dla których warianty mniejszościowe przekraczają poziom 3,61%, zakładając co najmniej 10 000 – krotne pokrycie i sekwencjonowanie bibliotek Nextera XT DNA libraries przy użyciu MiSeq FGx.
Wnioski: Wiarygodność i czułość detekcji heteroplazmii punktowych przy użyciu MiSeq FGx zależy od polimerazy używanej do amplifikacji mtDNA. W związku z tym, zalecane jest zweryfikowanie protokołów laboratoryjnych używanych do detekcji substytucji w mtDNA przed ich zastosowaniem w celach medycznych lub sądowych.